lunes, 11 de junio de 2012
METODOS DE PURIFICACION Y ANALISIS DE LOS CS NUCLEICOS
Una purificación de proteínas es una serie de procesos que permiten aislar un sólo tipo de proteína de una mezcla compleja. La purificación de proteínas es vital para la caracterización de la función, estructura en interacciones de la proteína de interés, por ejemplo una enzima un receptor celular o un anticuerpo. El material inicial es generalmente un tejido biológico o un cultivo microbiano. Hay varios pasos en el proceso de purificación; puede liberar a la proteína de la matriz que lo confina, separar las partes proteica y no proteica de la mezcla, y finalmente separar la proteína deseada de todas las demás. Este último paso puede ser el aspecto más laborioso de la purificación de proteínas.
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que siginifica: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.
Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas difrenctes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, Hpatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diganóstico de identidad forense, etc.
La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para elminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.
Así se ve el ADN recíen extraído en alcohol.
¿Como visualizamos el ADN?
Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.
Para eso debemos prepar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras que sumergidas en el gel y este en un buffer conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica.
La Genética molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954. Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los 60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.
Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su paracticidad y rapidez para amplificar una region de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis.
Aplicaciones de las técnicas
Son inmumerables las aplicaciones de estas técnicas y quizás las más usadas hoy en dia, son la PCR seguida de una restricción con enzimas y detección de los fragmentos en un gel o seguidas de un gel de poliacrilamida que tiene más definición para la separación de fragmentos de pocas bases de diferencias. Cuando se usa PCR y enzimas de restricción se denominan PCR/RFLP (derivado de variación en la longitud de los fragmentos de restricción en ingles).
Esta técnica puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de un gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.
miércoles, 6 de junio de 2012
TAREA UNIDAD 9
LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES PUEDEN COMPARTIR PLASMIDOS NATURALMENTE ? SI, NO POR QUE ?
LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES SI PUEDEN COMPARTIR PLASMIDOS, YA QUE EN ESTE CASO TODAS LAS BACTERIAS TIENEN SU PARED BACTERIANA, ESTA CONSTITUIDA DE LOS MISMOS COMPUESTOS Y AL LLEGAR EL PLASMIDO CREERA QUE ESTAN TRANSFORMANDO UNA BACTERIA DE SU ESPECIE EN ESTE CASO SERIA COMO LOS PERROS DE DIFERENTES RAZAS SI PUEDEN REPRODUCIRSE EN TRE SI PERO TODOS SON PERROS Y TAMBIEN EN ESTE CASO TODAS SERIAN BACTERIAS, OSEA QUE SU MATERIAL GENETICO TIENE CARACTERISTICAS GENERALES PARA TODAS LAS BACTERIAS Y UN MISMO PLASMIDO PODRA TRANSFORMAR DIFERENTES BACTERIAS.
QUIMICOS
El Método del fosfato cálcico:
Uno de los métodos más baratos (y fiables) es la transfección mediante fosfato de calcio, originalmente descubierta por F. L. Graham y A. J. van der Eb en 1973. Una solución salina tamponada con HEPES y que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el DNA a transfectar. Cuando ambas se combinan, se forma un precipitado fino formado por el calcio cargado positivamente y el fosfato cargado negativamente, que el DNA en su superficie. Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar (normalmente un cultivo celular en monocapa). Mediante un proceso no comprendido completamente , las células toman parte del precipitado, y junto con él, el DNA.
Método del DEAE dextrano:
Otro método es el uso de polímeros catiónicos (o policationes) como DEAE-dextrano o polietilenimina. El DNA, cargado negativamente, se une al policatión y el complejo es endocitado por la célula.
Método DNA desnudo:
El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado.
Método Péptidos fusiogénicos:
Los péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.
Método de Liposomas:
Otros métodos usan compuestos orgánicos altamente ramificados, los llamados dendrímeros, para unir el DNA e introducirlo en la célula. Un método muy eficiente es la inclusión del DNA en liposomas, pequeños cuerpos formados de una membrana en cierto modo similar a la membrana plasmática de la célula y que puede fusionarse con la misma, liberando el DNA al interior celular. Con células eucariotas, la transfección basada en la interacción lípido-catión es la más comúnmente utilizada, ya que son más sensibles a este método.
biologia.uab.es/genetica/curso/EnsayosAlumnos/.../metoquim.html
ciencia.glosario.net/biotecnologia/adn-desnudo-10034.html
biologia.uab.es/genetica/curso/EnsayosAlumnos/.../metoquim.html
ciencia.glosario.net/biotecnologia/adn-desnudo-10034.html
lunes, 4 de junio de 2012
.MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL: FISICOS
La microinyección: es un proceso que consiste en utilizar microagujas para insertar sustancias a un nivel microscópico o en el límite de lo macroscópico dentro de una célula viva. Es un simple proceso mecánico en el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido. La microinyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado micromanipulador. El proceso es frecuentemente usado como un vector en ingeniería genética y transgenética para insertar material genético en una célula. El proceso de clonación también involucra microinyecciones.
Las microagujas miden alrededor de 10 micrómetros. Pueden contener cerca de 15 microlitros de ADN. Es similar a la sección transversal de un cabello humano. Es un método muy preciso de transferencia génica. Requiere personal capacitado.
biobalistica: Pequeñas partículas de oro o tungsteno cubiertas de ADN, que se disparan a células vegetales jóvenes o embriones vegetales. Algo del material genético se quedará en las células, transformándolas. Éste método también permite la transformación de plastidos. La eficiencia de transformación es más baja que utilizando Agrobacterium, pero la mayoría de las plantas pueden ser transformadas con este método.
Electroporación: Crea agujeros momentáneos en la membrana celular utilizando golpes eléctricos; esto permite que el ADN entre a la célula, como se ha descrito anteriormente con las bacterias.
TRANSFECCION
La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no virales se usa en referencia a células de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere para describir las transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
La transfección de células animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios en la membrana plasmática de las células mediante electroporación, para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos, por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.
El significado original de "transfección" era "infección por transformación", es decir, introducción de DNA o RNA desde un virus procariótico ó bacteriófago en las células, resultando en una infección. Al tener el término transformación otro sentido en biología celular animal (un cambio genético que permite la propagación durante largos periodos de células en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerígenas), el término transfección adquirió, para células animales, su actual signifiado de cambio en las propiedades celulares por la introducción de material genético.
TRANSDUCCION
Los bacteriófagos son virus que parasitan bacterias. Tienen una estructura compleja formada por una cabeza, que contiene el material genético, y una cola que consta de unas fibras con las que se anclan a la superficie bacteriana. El material genético del bacteriófago pasa desde la cabeza, a través de la cola, hasta el interior de la bacteria.
El material genético del virus se integra dentro del material genético bacteriano y se replica. De esta manera el virus se reproduce y forma nuevos bacteriófagos que acaban provocando que la bacteria se destruya y estalle.
CONJUGACION
CONJUGACION
Este proceso se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F, que contiene la información genética para formar pili, puentes que sirven de unión citoplásmica entre dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se denomina F+; la célula que no lo contiene se llama F-. La bacteria F+ (donadora de información) se une a una bacteria F- (receptora) mediante uno de sus pili.
A través de él introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se convierte en bacteria F+.En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo del ADN bacteriano. Entonces, la bacteria donadora se denomina Hfr (High frequency of recombination). De esta forma la bacteria Hfr puede donar a otras células cualquier gen de su ADN.
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