El ADN mitocondrial es el material genético de las mitocondrias, los orgánulos que generan energía para la célula. El ADN mitocondrial se reproduce por sí mismo semi-autónomamente cuando la célula eucariota se divide. El ADN mitocondrial fue descubierto por Margit M. K. Nass y Sylvan Nass utilizando microscopia electrónica y un marcador sensitivo al ADN mitocondrial. Evolutivamente el ADN mitocondrial desciende de genomas circulares pertenecientes a bacterias, que fueron englobadas por un antiguo ancestro de las células eucarióticas.

Este ADN, al igual que los ADN bacterianos, es una molécula bicatenaria, circular, cerrada, sin extremos (cromosoma mitocondrial). En los seres humanos tiene un tamaño de 16.569 pares de bases, conteniendo un pequeño número de genes, distribuidos entre la cadena H (de heavy, pesada en inglés y la cadena L (de light, ligera), debido a su diferente densidad cuando son centrifugadas en gradiente de CsCl.

El número de genes en el ADN mitocondrial es de 37, frente a los 20.000 - 25.000 genes del ADN cromosómico nuclear humanos. Codifica dos ARN ribosómicos, 22 ARN de transferencia y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa. El cromosoma mitocondrial se organiza en "nucleoides", de tamaño variable y de unos 0,068 nanómetros de tamaño en humanos, y formados por entre 5-7 cromosomas y algunas proteínas, como el factor de transcripción mitocondrial A, la proteína de unión a ADN mitocondrial de cadena sencilla y la helicasa Twinkle. Su número por mitocondria es muy variable, pero su distribución se realiza a intervalos fijos, y muchos de ellos parecen localizarse en los "tubos mitocondriales". Parece ser que los nucleoides mitocondriales podrían tener un comportamiento "en capas", llevando a cabo la replicación en su centro, mientras que en la periferia sitúan la traducción de las proteínas necesarias para la cadena respiratoria. El número de tales nucleoides sería de varios cientos (400-800) en células de cultivo, y mucho menores en otras especies en que su tamaño es mayor.

El ADN mitocondrial está en replicación constante, independientementemente del ciclo y del tipo celular. Se piensa que tiene lugar de forma asíncrona, es decir, que tiene lugar en las dos cadenas en tiempos diferentes y con dos orígenes distintos hacia direcciones contrarias. El comienzo tendría lugar en el origen de la cadena pesada, situado en el bucle D, y replicaría ésta tomando como molde la cadena ligera. Cuando se alcanza el segundo origen, situado a dos tercios de distancia del primero, comienza la segunda ronda de replicación en sentido opuesto. Se ha propuesto un nuevo sistema de replicación que coexistiría con el primero. Sería bidireccional y comportaría una coordinación entre hebras directas y retrasadas. En la replicación en mamíferos estarían involucradas la polimerasa γ y la helicasa twinkle.

El ADN mitocondrial está sometido a un importante estrés por su proximidad con los centros de producción de radicales libres de oxígeno, de forma que disponen de una varia y compleja maquinaria de reparación, lo cual incluye diversas formas de recombinación, tanto homóloga como inhomóloga.

El genoma mitocondrial de los eucariotas se originó probablemente tras la endocitosis de una eubacteria aeróbica y la subsecuente transferencia sucesiva de muchos genes hacia el genoma nuclear.

Esta hipótesis surgió debido a que la organización del genoma mitocondrial es radicalmente diferente del genoma nuclear. Los genomas mitocondriales presentan varias características de los genomas procariotas como:

• Pequeño tamaño.
• Ausencia de intrones.
• Porcentaje muy elevado de ADN codificante.
• Falta generalizada de secuencias repetidas y genes de rARN comparativamente pequeños, parecidos a los de procariotas.

La evolución del código genético mitocondrial es probablemente el resultado de una presión de selección reducida en respuesta a una capacidad codificante muy disminuida.

Representación del ADN mitocondrial mostrando los loci afectados en algunas enfermedades humanas.